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关于玉米品种真实性鉴定的几点思考

放大字体  缩小字体 发布日期:2022-05-12  来源:南北学苑  作者:王凤格  浏览次数:1029
 
      以下文章来源于南北学苑 ,作者王凤格
 
      是谁出的题那么的难,到处都是正确的答案。- 何勇《钟鼓楼》
 
      我自 2001 年参加工作以来,一直致力于分子技术在种子质量检测及辅助育种中的应用研究,特别是品种真实性和纯度鉴定方面。前年在群里曾分享了关于品种纯度鉴定的一些思考,一直想再对品种真实性鉴定进行思考、总结并分享,只是内容涉及较多,还没有学会如何系统化整理。这次下定决心,努力尝试一下,希望对各位同行有一定的启发作用。
 
      有人说,纯度是世界性的研究需求,而真实性是中国特色的研究需求,认为中国种业的大环境催生了品种真实性问题。这个认识显然并不客观。其实,真实性与纯度一样,也是世界性的需求,只是不同国家、不同发展阶段的需求有多少的问题,但并不是中国特色,不研究不意味着没有需求。我国用 20 多年的时间,逐步建立起成熟的品种真实性分子鉴定体系,为我国种业健康发展起到了保驾护航的作用,也为其他国家的品种真实性管理提供了成熟经验。
 
      简单回顾一下我国在玉米品种真实性分子鉴定上的发展历程:
 
      在技术标准化方面:2007年,在对 SSR 技术不断优化完善的基础上,在玉米上颁布实施了行业标准《玉米品种鉴定技术规程 SSR 分子标记法》(NY/T1432-2007),该标准成为司法鉴定中应用最多的作物分子鉴定标准;该标准于 2014 年进行修订,将高效毛细管电泳技术纳入到标准中。2014 年,借鉴国际 UPOV-BMT 测试指南并结合玉米等分子标准的应用实践,制定并颁布了行业标准《植物品种鉴定 DNA 指纹方法总则》(NY/T2594-2014),总则的实施推动了其它几十种农作物的分子鉴定技术标准化进程。2022 年,随着 SNP 新型分子技术的成熟完善,颁布了行业标准《玉米品种鉴定技术规程 SNP 分子标记法》(NY/T4022-2021)。
 
      在玉米品种 DNA 指纹库构建方面:2005 年农业部开始玉米区试标准样品保藏;2010年启动玉米、水稻小麦棉花大豆油菜六大主要农作物审定品种标准样品征集,收集样品 1.4 万份;2015 年农业部发布“农作物品种 DNA 身份鉴定体系构建”方案,由北京市农林科学院玉米研究中心作为技术牵头单位,联合水稻、小麦、棉花等主要农作物研究单位,建立基于 SSR 标记的主要农作物品种标准 DNA 指纹库;2016 年启动科技部国家重点研发计划项目“主要农作物种子分子指纹检测技术研究与应用”,由北京市农林科学院玉米研究中心作为项目主持单位,构建了基于 SNP 标记的、库容 5万份以上的七大作物 DNA 指纹库。
 
      在应用领域方面:2002 年起在国家级区域试验中开始利用DNA指纹技术进行玉米区试组合的真实性与一致性检测,并逐步从普通玉米扩展到鲜食玉米、青贮玉米,从玉米扩展到小麦、水稻等其它主要农作物,从国家级试验扩展到省级试验。2004 年起在玉米品种权保护 DUS 测试中开始探索辅助筛查近似品种,并逐步启动品种权保护样品建库。2010 年起在玉米种子质量监督抽查及种子执法中开始启动大规模真实性分子鉴定,包括春季市场抽查、夏季基地巡查、冬季企业督查等。
 
      在政策法规方面:2005 年起在玉米国家区试中试行《国家玉米品种试验 DNA 指纹鉴定管理办法》,对同一品种不同试验年份或试验组别的样品遗传差异大的(差异位点≥2)停止试验,试验品种与已知品种相同或高度近似的(差异位点≤1)停止试验。2016 年新种子法中将 DNA 等快速检测结果列为执法依据,推动了 DNA 指纹技术在企业维权和司法鉴定中的应用。2022 年新修订的国家级玉米品种审定办法,将审定品种与已知品种的差异位点数由 2 个提高到 4 个,对品种选育的自主创新要求进一步提高。下面我将多年来在玉米品种真实性鉴定中的研究、应用与思考进行总结并和大家分享一下。
 
      品种真实性概念解析
 
      1)品种真实性鉴定真实性鉴定是对品种真实身份的鉴别,侧重考察品种间是否存在明显差异。真实性鉴定的过程是“找差异”的过程。从检测目的看,可分为真实性验证和真实性身份鉴定两大类。真实性验证属于一对一的成对比较,一般指待测样品与标准样品或对照样品进行比较,检测该样品的品种名称是否名副其实。具体分以下几种情况:
 
      (1)与已审定品种标准样品比较。主要目的是进行市场打假,规范市场秩序,送样单位一般为各省种子管理站、工商管理局等行政执法部门。
 
      (2)与来自农业部品种权保护的标准样品比较。主要目的是鉴定是否发生侵权,送样单位一般为司法机构或品种权人。
 
      (3)同一品种不同来源样品之间比较。在区试中主要目的是监控同一品种在不同参试年份或不同组别是否发生和更换;在品种权保护中主要目的是监控由不同申请单位提供的同名的近似品种样品是否相同;在育种中主要目的是监控收集的不同来源同名自交系是否相同。
 
      (4)与模仿对象进行比较。育种单位采用模仿育种的方式进行育种,需鉴定改良后的品种与原品种在DNA水平上是否发生了明显变化,是否可以作为不同品种使用。
 
      (5)姊妹系或近等基因系之间比较。育种单位采用连续回交、诱变、突变、转基因等方式选育的自交系与其原始自交系之间,或采用二环系方式选育的连续自交6代后的不同姊妹系之间,遗传相似度一般比较高,需要确定是否可以作为新自交系使用。
 
      (6)跟踪品种种性是否发生变化。主要目的是监控品种在多年的繁育过程中,或者育种者持续提纯复壮可能会带来的种性上的改变。特别是一些推广年限较长的品种,有可能与审定时相比已有明显改变,应作为不同品种重新进行区试审定,而不能继续推广。
 
      真实性身份鉴定属于一对多的比较,一般是指待测样品通过与已知品种标准指纹数据比对平台筛查比较,确定该样品的真实品种名称。这种检测需求的实现需要构建比较完备的已知品种标准指纹数据库,具体分以下几种情况:
 
      (1)在种子市场打假中,鉴定市场抽检的品种仿冒了什么已知品种。
 
      (2)在国家和各省区试中,鉴定区试品种是否与已知品种雷同,并作为品种能否推荐审定的必要条件。
 
      (3)在品种权保护中,辅助筛查申请品种的最近似品种,代替原来由申请者自行提供。
 
      2)玉米品种真实性鉴定与人类个体鉴定的比较品种鉴定与个体鉴定均是种以下的鉴定,二者主要区别如下:
 
      (1)品种鉴定是对该品种的同质群体的整体描述,而非对该品种的每一个个体的分别描述;个体鉴定是对每个单独个体进行鉴别,适用于群体内部不同个体间差异大、区分个体有意义的情况,个体鉴定在植物上的需求较少,在人类及某些动物物种上需求较多。
 
      (2)同一品种可多年多点组配或繁殖,对于自花授粉作物的品种或异花授粉作物的自交系,存在自交不充分或突变带来的品种(系)内剩余杂合位点问题,对于杂交品种,存在制种过程中隔离或去雄措施不力带来的纯度问题,造成不同年份、不同地点生产的种子之间可能出现若干微小差异;而个体鉴定时,同一个体在不同时期的取样不存在变异。
 
      (3)品种选育过程是育种家对材料进行人工改造的过程,可创造出大量遗传背景高度近似的品种,因此品种鉴定需要预先知道品种的变异范围作为判定阈值;而个体鉴定所面对的个体是确定不变的,不同个体在DNA序列上应存在可鉴别的差异。
 
      (4)由于玉米杂交种是由独立的两个自交系杂交组配而成,而这两个自交系均可独立地与其它许多自交系组配,特别是优良自交系,其使用频率极高,造成大量品种是同父异母或同母异父,这对玉米品种鉴定提出了更高的要求。而人类具有一个或两个共同亲本的个体要少的多。
 
      3)与真实性有关的词语张冠李戴:包装袋内装的种子与包装袋上标注的品种名称不符。这种是一般意义上的真实性有问题的种子。
 
      假而不劣:包装袋内装的是优良品种的种子,且纯度、发芽率等质量指标符合要求,但包装袋上标注的是其它品种的名称。这是一种特殊类型的真实性有问题的种子,一般是为了避开优良品种的品种权,所以包装袋上用自己的审定品种名称,装的是郑单958等获得品种权的优良品种种子。
 
      真假难辨:采用模仿育种的方式选育的品种,在 DNA 水平上遗传差异较小,在表型上虽有微小差异,但需要特殊的调查方法或较长的时间(比如抗病性需要接种或特殊发病条件、品质需要仪器检测、轴色需要在生长后期才能调查等)。
 
      这些品种如果通过审定进入市场后,无论是被模仿的原始品种还是模仿产生的新品种,都会带来维权难的问题。例如,大丰 30 与先玉 335,利用标准中的 40 个SSR引物检测,只有 1 个位点差异,在表型上仅有轴色深浅的差异,很难有快捷高效的手段对市场上抽检的这两个品种的样品准确甄别出是哪个品种。
 
      半真半假:待测样品虽然标签上显示是某品种,但在该品种中还掺混了一定比例的另一品种,这种混合种子就是一种半真半假的情况。在真实性检测时,无论与标签显示的品种还是与另一品种的标准样品比较,都可能会判为无明显差异,对真实性鉴定结果的出具造成干扰。
 
      品种真实性鉴定与其它鉴定项目的比较
 
      1)真实性鉴定与特异性鉴定、派生关系鉴定的比较真实性鉴定和特异性鉴定均是检测不同品种(样品)之间的关系,但二者还是有一定区别的:
 
      (1)从概念和应用范畴上讲,真实性是指一批种子所属品种、种或属与文件描述或与备案的标准样品是否相符,是种子检测系统中使用的名词;特异性是指申请品种权的植物新品种应当明显区别于在递交申请以前已知的植物品种,是品种权保护系统中使用的名词;
 
      (2)从检测目的上讲,真实性鉴定是检测种子是否与标示的品种名称相符,是否具有真实性是判定种子质量是否合格的指标之一;特异性鉴定是检测申请品种是否与所有已知品种都不同,是否具有特异性是判定是否成为新品种的必要条件;
 
      (3)从所处阶段及检测对象上讲,真实性鉴定一般在种子进入销售市场阶段进行,检测对象是进入生产和销售环节的商品种子,特异性鉴定一般在区域试验阶段和申请品种权保护阶段进行,检测对象是尚未通过审定或获得授权的试验用种;
 
      (4)从检测方案上讲,真实性鉴定主要是待测样品与标准样品比较,如果不符则判定为真实性有问题,特异性鉴定是待测品种与所有已知品种比较,如果均不同则判定具有特异性。
 
      当然,两者在检测技术方法选择上是具有共性的,在检测实践中两种检测需求也存在一定交叉,例如,在区域试验阶段,一方面需要保证待测组合与所有已知品种不同,即具有特异性,一方面需要保证待测组合在不同年份、不同区组或不同省份参试时不会发生更换组合,即具有真实性。而且,由于国内种子市场中仍存在个别品种在审定时不具有特异性就进入生产销售阶段的情况,在种子质量市场监管阶段,往往会出现真实性和特异性的问题并存的现象。
 
      除了特异性,在 UPOV 公约 91 年文本中,还提出了实质性派生品种(简称 EDV)的概念。我国近年来也在积极推进实质性派生品种制度的实施,比如农业农村部 2018 年一号文件《关于大力实施乡村振兴战略加快推进农业转型升级的意见》指出要“探索建立实质性派生品种保护制度”;农业农村部种业管理司《2019 年推进现代种业发展工作要点》提出“积极探索实施实质性派生品种制度试点工作”。
 
      品种派生关系鉴定(EDV鉴定)是对品种权保护中已判定具有特异性的品种,进一步回答是独立的品种还是与原始品种存在派生关系。与真实性鉴定相比,派生关系鉴定更侧重考察品种间的遗传背景的相似程度,因此所用指标为遗传相似度。派生关系鉴定的过程是“找相似”的过程。图1展示了派生品种鉴定的思路:
 
 
图1 独立品种、派生品种、原始品种之间的关系
 
      2)真实性鉴定与亲子鉴定
 
      品种真实性鉴定和亲子鉴定均是检测不同品种(样品)之间的关系。对玉米而言,品种真实性鉴定是玉米杂交种间的比较或自交系品种间的比较,判定
 
 
      是否相同。而亲子鉴定是杂交种与自交系之间的溯源(见下图),追溯组配杂交种的上一代亲本自交系的鉴定,判定是否符合孟德尔遗传。玉米品种的亲子鉴定可以借鉴人类亲子鉴定的算法和概念,将亲子鉴定分为三联体,二联体和双亲皆疑三种情况:
 
      (1)所谓三联体,是指提供杂交种F1及杂交种的确定亲本1、假设亲本2,判定假设亲本2是否是杂交种的真正亲本。
 
      (2)所谓二联体,是指提供杂交种F1及杂交种的假设亲本1,判定假设亲本1是否是杂交种的真正亲本。
 
      (3)所谓双亲皆疑,是指提供杂交种F1及杂交种的假设亲本1、假设亲本2,判定亲本组合“假设亲本1×假设亲本2”是否是杂交种的真正亲本组合。
 
      作物品种的亲子鉴定的思路有四种:
 
      (1)采用SSR、SNP等共显性标记,利用种子上的种皮、果皮等母本残留组织(如玉米的果皮、水稻的稻壳、豆类的豆荚、瓜类的果壳等)直接获得母本基因型,并结合杂交种基因型,依据孟德尔遗传规律,推测出父本基因型。该思路在双亲未知,仅有杂交种种子情况下就可以同时获得杂交种及其双亲的基因型。
 
      (2)利用胚乳等母本父本成分比例不同的组织,结合共显性标记,分解出双亲基因型。谷类作物胚乳中母本和父本成分所占比例为2:1,采用杂合子对称扩增的共显性标记进行分型,母本和父本的两个等位基因的扩增产物量应为2:1,因此占比为2的等位基因来自母本,占比为1的等位基因来自父本。该思路在双亲未知,仅有杂交种种子情况下就可以推测出双亲,适用于胚乳较大且容易剥离的种子,如玉米、小麦等单子叶植物的种子。
 
      (3)根据杂交种的基因型,利三联体或二联体算法,从已知的自交系库中筛查出可能的亲本自交系,或利用双亲皆疑算法,从已知自交系库中筛查可能的双亲组合。该思路适用范围较广,但需要有数据库支持。
 
      (4)利用叶绿体等母系遗传成分,推测杂交种的可能母本自交系。该思路受限于叶绿体、线粒体等细胞质成分的序列变异程度较低,只能作为亲子鉴定的辅助手段。
 
      3)真实性鉴定与纯度鉴定
 
      真实性和纯度均是种子检测系统中使用的名词,检测对象是进入生产和销售环节的商品种子,是判定种子质量是否合格的指标。
 
      检测实践中,许多人真实性鉴定和纯度鉴定混为一谈:在制定真实性鉴定标准时,有人提出在真实性鉴定前必须先进行纯度鉴定,剔除不代表本品种的个体后,用标准个体进行真实性鉴定;在制定纯度鉴定标准时,有人提出在纯度鉴定前必须先进行真实性鉴定,只有真实性没有问题的样品才能进行纯度鉴定。实际上,如果纯度鉴定的前提是样品必须具有真实性,或者真实性鉴定的前提是样品必须纯度达标,则大大增加了鉴定的复杂度,无法简单快捷的开展纯度鉴定。
 
      检测实践中,应将真实性鉴定和纯度鉴定作为两个独立的鉴定项目,二者具有明显的区别(具体区别详见下表):真实性鉴定涉及不同样品之间的关系,检测结果用不同、近似、相同等表示;而纯度鉴定涉及同一样品内部不同个体之间的关系,检测结果用本品种的种子数占供检样品种子数的百分率表示。
 
      4)真实性鉴定与转基因鉴定真实性
 
      鉴定和转基因成分鉴定是目前分子检测机构开展的两类最常见的分子鉴定项目,两类项目采用的技术手段相似,在实验室硬件条件和人员培训上的要求基本相同,因此许多实验室都在同时开展这两项鉴定。然而二者的差异还是很明显的:
 
      (1)从鉴定标记上看,真实性鉴定是对样品整体遗传背景的检测,选用的 SSR 标记具有物种特异性,玉米真实性鉴定的核心引物并不适用于其它物种,而转基因鉴定是对目的基因的鉴定,检测样品中是否含有外源基因,选用的鉴定标记只与所鉴定基因有关,具有物种通用性。
 
      (2)从检测方式看,真实性鉴定涉及样品之间的关系,预先构建可共享的已知品种标准DNA 指纹库对开展真实性鉴定具有重要价值,而转基因鉴定仅涉及待测样品本身,不需要预先构建 DNA 指纹库。
 
      (3)从试验污染控制上看,真实性鉴定的试验污染主要出现在样品准备阶段,系同批次样品的相互交叉污染,环境中的外源核酸一般不会对检测产生影响,而转基因鉴定的试验污染主要出现在 PCR 扩增及电泳阶段,环境中的外源核酸容易导致检测结果出现假阳性,因此转基因鉴定的试验污染控制更加严格。
 
      随着转基因品种审定放开,针对转基因品种的鉴定,不会仅局限于转基因成分鉴定,至少会增加以下几种新的检测内容:(1)检测转基因品种的遗传背景与原品种是否相符,如果相符,作为原品种 EDV 品种,简化区试试验程序;如果不相符,不作为原品种的EDV 品种,不能简化区试试验程序。(2)检测转化体事件与申报的是否相符,即转化体事件真实性。(3)检测转化体事件纯度是否达标。
 
      5)真实性鉴定与自交系溯源
 
      自交系(或纯系)溯源是指追溯自交系(或纯系)品种的可能祖先的鉴定。从实际鉴定需求看,分为两种情况:一是鉴定育种家在新自交系或纯系品种选育过程中使用了哪些已有的种质资源作为选系亲本,上溯的世代一般不超过十代;二是鉴定自交系的可能远古祖先,上溯的世代可达到上万年。这类鉴定的思路有两种:
 
      (1)利用叶绿体、线粒体等细胞质基因组差异实现母本祖先的追溯。叶绿体、线粒体等细胞质成分系母系遗传,不发生基因组的重组交换,且基因组序列保守性较强,能够追溯到较远世代的母本祖先。这个方案的缺点是只能追溯到母本,无法追溯到父本。
 
      (2)利用核基因组差异实现祖先的追溯。通过在核基因组上找到重组率低(或不重组)的区域,并在这些区域进一步筛选突变率较高的区域,这些区域就能发挥类似叶绿体、线粒体基因组的溯祖作用,且可以追溯到双亲。
 
      品种真实性鉴定的几种可能方案
 
      1)核心位点组合法(方案1)真实性鉴定的第一个方案是采用一套固定的核心位点组合鉴别不同品种。核心位点组合法自 2003 年首次提出来后,在作物品种的分子鉴定实践中发挥了重要指导作用。已有几十种作物相继筛选了本作物的核心引物组合,并应用于DNA 指纹库构建和品种真实性鉴定中。核心位点是优先选用的具有多态性高、重复性好、分布均匀等优点的一套位点组合,综合 UPOV 组织制定的《BMT 分子测试指南》和我国颁布的《植物品种鉴定 DNA 指纹方法总则》的相关内容,核心位点选择的指标包括多态性高、数据容易统计、重复性好、不同平台兼容性好、染色体分布情况清楚、在基因组上均匀分布、避免选择零等位变异等。
 
      不同作物核心位点组合的确定主要依据不同植物属(种)的品种数量及品种间差异情况、染色体数目及基因组大小、位点多态性水平,兼顾不同标记技术和不同检测平台的位点通量特点、检测的速度和成本,并能够区分该植物属(种) 95% 以上的已知品种,核心位点组合的位点数量一般在几十到几百个之间。
 
      图 2 展示了核心位点组合法的原理:鉴定位点包括核心位点和扩展位点两大类,其中核心位点分为分组位点和品种区分位点两级,位点数量分别在 1-10 个和 10-100 个的范围,扩展位点可分为若干级,随着位点数量增加逐级扩展(图 2A)。面对大量品种,首先用核心位点中的分组位点将品种分为几大组,然后用核心位点中的品种区分位点鉴别组内不同品种,对于仍然无法区分的品种,继续用扩展核心位点进行鉴别(图2B)。
 
 
图2 核心位点组合法的原理A:位点类型及各类位点的数量;B:品种DNA指纹鉴定的过程
 
      2)特异分子标签法(方案2)品种真实性鉴定的另一个方案是为每一个品种找到一个独特的序列标签(在电泳平台上表现为谱带或峰,在测序平台上表现为一条 DNA 序列),该序列标签和品种之间建立一对一的关系。
 
      早期提出的特征谱带法,即针对固定的一套品种进行大量的标记筛选,为每个品种找到一个特异分子标记,该方案仅在品种名单范围固定的情况下有效,当扩大范围后,原来具有特征谱带的品种往往不再具有特征带。
 
      为了解决原有特征谱带法的困境,进一步提出了特异分子标签法,该方案的要点如下:
 
      (1)分子标签必须是从外部导入的,且导入的标签必须是该物种基因组中不存在的序列。这就避免了特征谱带法从本物种基因组内部找的某一品种的特异标签理论上不能排除其它品种也会具有的问题。
 
      (2)分子标签应导入到重组率较低的染色体区域中,避免在杂交过程中因发生重组而容易丢失。
 
      (3)分子标签可以是有意义的基因序列,也可以是不会造成表型改变的完全无意义序列,因此可以人工创造一条全新的特殊序列。
 
      (4)分子标签可通过远缘种杂交、转基因或基因编辑的手段导入到目标品种上。分子标签在导入一个品种之前,是该物种以前的所有品种中没有的,在导入一个品种上之后,只要有人使用该品种作为育种亲本材料,就有可能将标签传递到新品种中去,因此标签不仅可以发挥鉴定的作用,还可以发挥跟踪溯源的作用。图 3 显示了特异分子标签法的原理,该方法秉承了标签法的思想,在常规标签法和分子标签法的基础上发展而来。常规标签法的标签与品种之间是松耦合的,标签容易发生脱落或交换,需要靠法律或规章约束才能保证标签与实物相符;分子标签法通过从品种的核基因组上寻找 DNA 标签,实现了标签与品种之间的紧耦合,但由于标签来自物种内源的基因组序列,其特异性很难保障;特异分子标签法通过从外源导入非本物种的独特的 DNA 标签,进一步解决了标签的特异性问题。
 
      随着基因编辑等新技术的成熟应用,将有望实现为每个品种添加本品种或本企业特有的标签序列。
 
      3)两种鉴定方案的比较
 
      核心位点组合法和特异分子标签法是两种不同的鉴定方案,各有优势,可根据不同的需求选择合适的鉴定方案。核心位点组合法的优势:所有品种都通过一套固定核心位点组合进行区分,不需要为每个品种确定一个特异的标签,适合大规模品种的统一鉴定和管理。而该方案的局限性:该方案能够明确做出品种不同的判定,但不能做出品种相同的判定;鉴定一个品种所需的一套核心位点组合数量少则几十到几百,多则几千到几万,试验及数据分析的工作量较大;需要预先构建基于核心位点组合的已知品种标准DNA指纹库,并结合表型和系谱信息,确定合适的判定阈值。
 
      特异分子标签法的优势:每个品种只需要检测其特异的标签,就可以确定是否为该品种,适合有重要价值的大品种的频繁检测,例如玉米上针对郑单 958、京科 968 等大品种的维权打假。而该方案的局限性:采用某品种的特异标签鉴定时,如果鉴定结果表明不是该品种,不能进一步确定是什么品种,因此不适合对大量未知品种的检测;特异标签需要预先导入,目前的导入技术难度和成本还比较高;标签要想发挥鉴定和溯源作用,需要建立严格的保密管理,标签管理一旦失控,就会失去和品种的一一对应关系;品种在导入标签前需要预先证明其具有特异性,否则即使导入了标签也不能作为具有特异性的品种对待。
 
      品种真实性鉴定技术的选择
 
      1)表型鉴定与分子鉴定的比较与分子鉴定通过选取一套核心位点组合的方案相似,在植物品种权保护上也建立了一套基于形态性状的品种鉴定体系-DUS 测试,通过选择一套适合的形态性状进行表型数据采集,采用数据库比较或成对并排种植比较鉴定品种间的差异。由于两种鉴定体系的目标都是进行品种鉴别,必然面临着表型鉴定和分子鉴定的结果如何结合的问题。在植物新品种保护联盟(简称 UPOV )的框架下,提出了三种可能的结合方式:一是利用与形态性状连锁或基因内的分子标记,即功能标记进行形态性状的预测,这种方式难度较大,仅在某些抗病性状、雄性不育性状上进行了少量研究,但仍不能做到完全一一对应。二是建立形态性状差异和分子标记性状差异之间的相关性关系,这种方式是目前的研究重点,已经在玉米、大麦等作物上进行了有益的探索,初步结果表明二者具有一定的相关性,但并非线性相关关系,基于已有研究结果,建立形态性状和分子标记结合使用的应用模型。三是将 DNA 指纹作为一套不同于形态性状的独立鉴定系统,建立自己的鉴定规则,这种方式在人类身份鉴定上得到采用,在植物品种鉴定上虽未达成一致的意见,但进行了有益的尝试,在玉米上分别建立了 SSR 和 SNP 的分子鉴定体系,并表明这两套分子鉴定体系之间具有高度的相关性。
 
      值得思考的问题是:为什么在人类 DNA 指纹身份鉴定中不仅不需要分子标记和表型之间有关联,还要求尽量避免分子标记与表型之间存在关联,以防止 DNA 指纹采集会带来个人隐私的泄露;与表型关联的分子标记并不是用于身份鉴定需求,而是用于疾病筛查等特殊目的。因此,从品种鉴定的角度看,是否需要建立表型与分子标记的关联仍是一个值得商榷的问题。
 
      2)不同分子标记的类型及特点
 
      (1)按所在基因组类型分类基因组类型主要分为细胞核基因组和细胞质(叶绿体,线粒体等)基因组。位于这两类基因组上的分子标记,具有不同的遗传规律。a)位于细胞核基因组:孟德尔遗传。变异主要来源于重组和突变。b)位于细胞质基因组:母性遗传。变异主要来源于突变。
 
      (2)按是否位于染色体特定位置分类在分子标记发展的早期,由于没有丰富的基因组测序信息,设计的分子标记一般是随机标记,检测基因组的位置是不确定的,或未知的。而随着基因组测序技术的成熟及大量物种的基因组测序,就可以针对基因组特定位置上的变异设计标记,检测位置是固定的。a)随机标记:代表性标记包括RAPD、AFLP、ISSR。优点:跨物种通用引物,多位点同时检测。缺点:间接反映基因组的变异类型,不利于数据整合及建库。b)特异标记:代表性标记包括SSR、SNP、INDEL。优点:有利于数据整合及建库,直接反映基因组的变异类型。缺点:一般不能跨物种使用。
 
      (3)按染色体的变异类型分类染色体的变异类型很多,小的序列变异由于容易开发分子标记,在品种鉴定中得到广泛应用。而大的序列变异,虽然更容易造成基因型和表型的明显变化,但一是数量较少,二是不容易开发合适的分子标记,尚未在品种鉴定中广泛应用。a)小的序列变异:包括SSR(简单重复序列重复次数变异)、SNP(单个核苷酸变异)、INDEL(小的序列插入或缺失变异)。
 
 
      大的序列变异:包括基因组上大片段的插入、缺失、重复、倒位、易位等。
 
      (4)按单一变异还是复合变异分类对所开发的分子标记而言,目标检测区域内可能包括1个变异,也可能包括多个变异,可能只有1种变异,也可能有多种变异。检测区域如果只有一个变异,检测方法一般比较简单,是目前最主要的分子标记类型。检测区域有多个或多种变异的,以往由于没有合适的检测平台,在分子标记开发中,往往会预先将这类变异过滤淘汰。随着测序技术的不断成熟和广泛推广应用,复合变异类型也有了检测平台,因此未来这类变异也可以使用。a)单一变异:检测区域内只有一个变异,如SSR、SNP、INDEL等。b)复合变异:检测区域内存在多个变异或多种变异。优点:单个检测区域的多态性增加。缺点:增加基因型统计的复杂性,且只能采用测序平台检测。
 
 
      (5)按等位变异数是两个还是多个分类对于一个变异位点,其等位变异数有多少个,是该变异位点的重要特征之一。然而,等位变异数多少是一个双刃剑:等位变异数少,区分能力弱,但数据标准化和整合更容易;等位变异数多,一般该位点的区分能力强,但数据标准化和数据整合难度增加。a)等位变异数只有两种:分子标记表现为二态型,如SNP、INDEL。优点:有专门针对二态型标记的样品高通量的KASP平台和位点高通量的芯片平台。缺点:多态性较低,杂合基因型只有1种。b)等位变异数超过两种:分子标记表现为复等位基因。如SSR等。
 
      (6)按物种特用还是物种通用分类物种数量非常庞大,是针对每个物种开发仅适合该物种的分子标记,还是为所有物种提供一套物种通用型分子标记或检测方案,这是一个问题。早期阶段,由于没有丰富的基因组测序信息,因此发展了RAPD、AFLP等适合大多数物种的随机标记;随着一批重要物种的基因组组测序数据的积累,这些物种就有可能开发物种特用的分子标记;然而,开发物种特用分子标记投入较大,对大量小物种而言,仍然需要提供物种通用型的检测方案。a)物种特用:根据特定物种的基因组序列变异情况,开发的适合该物种基因分型的标记。目前开发的SSR、SNP、INDEL标记主要是针对特定物种开发的。b)物种通用:有三种途径,一是随机标记,如RAPD、AFLP、ISSR;二是利用物种间的共线性,开发在不同物种都能检测到特定位置变异的物种通用标记:三是直接测序,如简化测序、低深度重测序等。
 
      (7)按是否与表型相关分类中性学说认为分子水平上的大多数突变是中性或近中性的,自然选择对它们不起作用,这些突变全靠一代又一代的随机漂变而被保存或趋于消失,从而形成分子水平上的进化性变化或种内变异。目前开发的分子标记主要是这类中性标记,由于受选择压力的影响较小,群体的等位基因频率分布均匀,因此其品种识别能力较强。与表型变异相关的功能标记开发的比较少,主要应用在分子辅助育种中,在品种鉴定中应用较少。a)中性标记:在基因组上随机选取的,与表型性状没有明显相关的标记。b)功能标记:根据功能基因内部引起表型性状变异的多态性基序开发的标记。
 
      品种真实性分子鉴定标准的研制
 
      大规模开展品种真实性鉴定需要成熟的分子鉴定标准,既包括为每个作物制定的技术标准,也包括指导所有作物标准研制的指南或总则。
 
      1)国际 BMT 分子测试指南与我国植物品种鉴定 DNA 指纹方法总则 BMT 分子测试指南是国际植物新品种保护联盟(UPOV)为建立一套统一的试验方法,以期在分子检测过程中获取高质量的分子数据,同时满足不同实验室利用不同技术方法构建植物品种DNA指纹数据库的需要而制定的分子测试指南,该指南对分子标记的选择、分析材料的来源类型及样品量、分析方法的标准化、数据库构建的标准化进行了原则上的规范,对利用分子检测技术开展品种测试及DNA指纹库构建具有重要的指导意义。
 
      我国于1999年4月23日正式加入《国际植物新品种保护公约》1978年文本,成为UPOV第39个成员国,我单位自2005年开始参加BMT历届会议,跟踪国际上DNA指纹技术在各类植物品种鉴定上的最新应用进展,并参与BMT分子测试指南修订。
 
      参考BMT分子测试指南,同时结合我国目前品种鉴定技术发展水平,2014制定适用于我国的植物品种鉴定的DNA指纹方法总则,并于2016年进行了修订。行业标准《植物品种鉴定DNA分子标记法总则》(NY/T2594-2016)从DNA分子标记类型的基本条件、核心和扩展的选择原则、样品制备、检测程序、数据库构建的基本要求、指纹数据统计规则等方面对DNA指纹数据库构建进行了全面的规范,对加快各个作物分子鉴定标准研制发挥了重要的指导作用。
 
      在此基础上,我国已经颁布了粮食作物普通小麦、高粱、大豆、小麦;纤维作物陆地棉、棉花;蔬菜作物大白菜、黄瓜、结球甘蓝、番茄、辣椒、甘蓝型油菜;瓜果类作物苹果、西瓜;花卉作物百合等多种作物分子鉴定标准。
 
      2)玉米品种真实性分子鉴定系列标准玉米品种真实性鉴定标准研制中的关键指标主要包括以下几个方面:
 
      (1)样品取样方式和取样量的确定。选择最佳的取样方式和最优的样本数量在真实性鉴定中具有重要意义,不仅关系到检测结果是否准确,还关系到工作量和检测成本等实际问题。玉米品种根据种子繁殖方式及样品预期一致性情况,可选择混合取样或个体取样进行检测。
 
      (2)核心位点的筛选确定。基于多平台、多实验室的广泛测试,代表性样品的多态性评估、引物组合区分效率、均匀分布、扩增片段大小等原则确定核心位点。经过上述筛选程序,玉米分别筛选确定96个SNP位点、40个SSR位点作为真实性鉴定的核心位点。
 
      (3)检测平台的选择。在选择适合的核心位点检测时,应选用配套的检测平台和多重实验反应体系,保证真实性鉴定中的结果具有可重复性和稳定性。SSR优先推荐选用荧光毛细管电泳检测平台,SNP优先推荐KASP荧光检测平台。
 
      (4)指纹数据的采集记录。SSR指纹数据采用等位变异大小统计法,即记录待测品种在每个引物位点上的电泳谱带片段大小作为等位变异的命名;SNP指纹数据采用等位变异统计法,即统计SNP的AGCT作为等位变异的命名。
 
      (5)参照样品的筛选和使用。使用参照品种的目的是辅助确定待测样品的等位变异以及校正仪器设备的系统误差。参照样品筛选时,为了提高参照样品使用时的便利性,一方面需要考虑参照样品的代表性和易获取性,一方面需要考虑如何用最少的参照样品代表鉴定位点的最多的等位变异。
 
      (6)结果判定。在使用较少的核心位点时,差异位点数作为判定样品异同的衡量指标。按照统一技术路线,选取代表性材料,在位点挖掘、实验效果评价、多态性分析、确定区分效率、多实验室验证等方面进行充分评估,确定玉米品种真实性鉴定位点组合及其配套标准化检测体系,制订了玉米分子检测系列标准,部分标准已经过了多次修订,包括:
 
      国家标准《主要农作物品种真实性和纯度SSR分子检测玉米》(GB/T39914-2021);部颁标准《玉米品种鉴定DNA指纹方法》(NY/T1432-2007);部颁标准《玉米品种鉴定技术规程SSR分子标记法》(NY/T1432-2014);部颁标准《玉米品种鉴定技术规程SNP分子标记法》(NY/T4022-2021);《玉米品种鉴定DNA指纹方法》(NY/T1432-2007)和《玉米品种鉴定技术规程SSR分子标记法》(NY/T1432-2014)已成为在司法鉴定中应用案例最多的农作物品种鉴定标准,在政府种子质量监督抽查、区域试验、品种权保护中发挥重要的技术支撑作用。
 
      《玉米品种鉴定技术规程SNP分子标记法》(NY/T4022-2021)中,与SSR检测标准相比,除了提供96个SNP位点用于真实性验证外,还进一步提供了61214个SNP位点进行品种真实性身份鉴定。
 
      对玉米品种真实性身份鉴定判定的阈值设定综合考虑玉米品种变异、现行标准或指南以及检测系统误差等各种因素,将判定阈值设为位点相似度92%-97%,即位点相似度≤92%的排除为同一品种,位点相似度≥97%疑似为同一品种,介于两者之间的为不确定区间,需提供其他辅助材料进行判定。该标准将于2022年6月1日正式实施,将对近似品种或派生品种的鉴定提供更加精准高效的技术手段。
 
      3)真实性鉴定标准的推广应用玉米真实性鉴定系列分子标准在我国已得到快速推广和应用,为种子市场的繁荣和稳定提供了有力的技术支撑:
 
      (1)种子质量监督管理上,2010年起,玉米真实性纳入到农业部种子质量管理中,在春季种子市场监督抽查中首次包括了真实性检测项目;2011年起,在扩大春季种子市场监督抽查规模的基础上,增加了冬季种子企业督查行动;2012年起,增加了制种基地夏季巡查;2013年起,增加了典型县市的种子市场摸底行动。至此,我国玉米种子真实性管理实现了从制种基地源头到企业加工中间环节到种子销售市场终端的全程监控体系。
 
      (2)区域试验管理上,2002年起,启动国家区试京津唐、黄淮海、西南和武陵山区四个组的玉米品种真实性检测,由北京市农林科学院玉米研究中心和四川省农业科学院作物研究所承担检测任务;2003-2004年将国家区试检测范围逐步扩大到所有8个普通玉米组,并由区试扩展到预试;2005年起制定并试行DNA指纹检测标准及管理办法,北京市农林科学院负责国家区试所有参试玉米品种标准样品入库长期保存,区试检测范围从国家区试逐步扩大到省区试,辽宁省率先启动区试玉米品种检测工作;2006年起,将国家区试检测范围扩大到青贮、甜糯、爆裂等特用玉米组,实现对国家区试组合检测的全覆盖;2007年起,逐步扩大省区试检测范围,至2014年已将玉米区试检测范围覆盖全国20多个玉米省份;2016年起,启动国家联合体、企业绿色通道试验,并将其纳入真实性检测范围。
 
      (3)品种权测试上,2004年起,开始探索分子技术在DUS测试中的应用;2010年起,构建品种权保护品种DNA指纹库,并辅助筛查近似品种;2016年起,探索派生品种鉴定的技术研究及标准化。
 
      (4)社会需求上,随着玉米真实性检测标准的颁布实施,来自企业维权、工商打假、司法鉴定、科研育种、农民维权等方面的检测需求呈逐年上升趋势。
 
      总结及未来展望
 
      1)技术选择:新旧之争对真实性分子检测技术的研发历程,伴随着对新旧技术的争议,特别是SSR和SNP两种标记技术,最终是替代关系,还是长期并存关系?在2010年左右的时候,就有人认为SSR已经过时了,SNP必将替代SSR。然而,十年后的今天,我们已经看到了答案,这两个技术是优势互补的:SSR技术具有多态性高,区分能力强的优势,可以用较少的位点区分大部分品种,适合电泳检测平台,从而有利于技术的推广普及;但数据整合共享有一定难度,且不易实现大量位点的高通量检测。
 
      而 SNP 技术有效弥补了 SSR 的不足,具有检测通量高的优势,可实现上万个位点或上万个样品的快速检测,且数据分型简单,数据容易实现整合共享;但丧失了 SSR 的优点,单个标记多态性低,区分能力弱,检测平台昂贵,限制了技术的大规模推广普及。
 
      在实际需求中,SSR 更适合品种真实性鉴定,特别是能够解决杂交种鉴定的问题;而SNP 更适合在自交系或育种群体中应用,特别是派生品种(EDV)鉴定、辅助育种中的前景和背景选择等。虽然就个别单位而言,因业务侧重点不同,可能会以其中一种技术为主体,但从全国总体而言,这两种技术未来将会长期共存。
 
      从更广泛的意义讲,技术没有新旧之分,只有是否有用之分。各种技术不断的被提出,经过大浪淘沙,大量的技术被淘汰,不留一丝痕迹,较少或从未被使用;少量的技术在一定时期、一定范围内得到使用,发挥了阶段性作用;极少数的技术被沉淀下来,在较长时期、较大范围内发挥作用,成为经典技术。可以确定,SSR和SNP技术是作为经典技术被保留下来的,还有巨大的使用空间。
 
      2)服务对象:一视同仁在玉米上,真实性分子鉴定技术已在区试、品种权保护、市场监督抽查、企业维权等领域发挥了重要作用。然而,偶尔会听到一些声音,认为真实性鉴定技术主要保护了国外公司的育种,存在为谁打假,为谁维权,为谁服务的疑问。为郑单 958 维权,没意见,为先玉 335 维权,怎么看?
 
      从检测实践看,无论对国内公司,还是国外公司,必须要一视同仁。正是在玉米上有了成熟的真实性鉴定技术,才让玉米产业得到良性发展,只有采用相同的规则,我们才能正视自己的不足,只有拥有与狼共舞的勇气与实力,我们才能快速成长进步。
 
      其实,正是采用相同的游戏规则,这 20 年来,国内玉米育种水平得到大幅提升,充分消化利用国内外育种资源后的自主研发品种成为主流,国内自育品种的维权需求也非常迫切。所以,真实性鉴定技术的保驾护航,不仅没有阻碍国内育种研发,相反是助力了玉米的国内自主育种。
 
      3)终极局面:天下无贼为什么要开展真实性鉴定技术研究?初衷显然是希望为品种及种子管理提供强大的技术手段,让政府管理更加高效,让农民用种更加安全,让企业品种创新更有动力,最终实现“天下无贼”的理想局面。当那一天到来的时候,真实性鉴定可能真的不需要了。
 
      技术的研发者希不希望同时作为技术的终结者?是否会忘了初衷,希望市场越来越乱,从而让自己的存在感越来越强?至少对真实性分子鉴定技术而言,这个顾虑是可以避免的:
 
      首先,对真实性鉴定的需求是不断深化的,从而需要技术不断的更新提升,常做常新,比如,随着转基因的放开,转基因品种具有不同于常规品种的特点,相应的真实性鉴定技术也要调整和改进;随着对品种创新要求提高,派生品种的鉴定需求也会逐步增多;随着申请品种权保护的自交系数量的增多,自交系维权具有不同于杂交种的特点,可能需要提供亲子鉴定等辅助手段;随着更多的作物类型纳入品种管理,物种专用型的真实性鉴定方案不利于检测机构高效开展检测,可能需要提供适用于多物种的通用型鉴定方案。
 
      其次,基于真实性鉴定需求研发的分子技术平台同样适用于种质资源研究、分子辅助育种等需求,即使管理品种的需求减少,创制优异新种质、选育优良新品种的需求并不会减少,且品种管理形成的分子大数据对育种还具有重要的参考价值。让我们期待那一天的到来。
 
 
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