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育种家有话说 || 小麦遗传新种质的创制及遗传分析

放大字体  缩小字体 发布日期:2022-08-18  来源:一麦众承  作者:倪永静  浏览次数:1418
 
      以下文章来源于一麦众承 ,作者倪永静
 
      作者简介:

      倪永静,1983年,2010年毕业于河南农业大学,作物遗传育种专业。2010年7月——至今,在商丘市农林科学院小麦研究所工作,从事小麦常规育种和遗传育种。与河南农业大学合作选育的小麦新品种“尚农6”“尚农8”于2022年6月通过河南省主要农作物审定委员会审定。另外在试品种7个。
 
      1创建小麦突变体库
 
      选用均匀一致的国麦301种子1kg,首先在冷水中浸泡4小时,然后用0.4%(v/v)EMS溶液在0℃处理种子2小时,接着在20℃处理14小时。排干EMS溶液,在流水中冲洗4个小时,晾干后种植于商丘市农林科学院双八试验基地。M₁代种子于2012年10月单粒播种,行距0.23m,株距0.08m,按单穗收获(即M₂种子);M₂种子于2013年10月种穗行,行距0.23m,株距0.08m。M₁、M₂均以未处理的国麦301为对照。田间管理按一般试验田进行。
 
      每7~10d田间调查一次,观察记载幼苗、叶形、茎、分蘖、穗部、育性等性状,筛选各种表型突变体。变异穗系全部单株收获脱粒后,观察记载籽粒形状、大小、颜色等性状。
 
      对M₂ 12020个穗系的主要农艺性状及其他生物学性状进行调查,共获得769个突变体系。其中,5个苗期致死、109个株高突变、177个叶片性状突变(幼苗期、成株期)、82个穗部性状突变、18个成熟期发生突变,64个分蘖突变,45个不育突变,52个籽粒突变,217个其他性状的突变。M₂中发生表型突变的频率约为6.398%。具体突变类型如表1,部分突变体类型展示如图1。
 
表1  EMS 诱变小麦新品种国麦301 M₂田间突变类型
 
 
图1部分突变体类型
 
      2 矮化独秆突变体dmc的生物学特征及遗传分析
 
      ▶2.1独秆突变体的获得及其生物学特征
 
      通过连续单株选择,获得了1个不分蘖突变体dmc纯合株系。该突变体完全不分蘖,只有一个主茎(图2-A),个别植株偶尔会有1个小分蘖。2016-2017年大田突变体株系dmc平均分蘖1.11个,突变亲本国麦301平均分蘖21.73个。突变体dmc植株明显矮小,株高48.00cm,是突变亲本国麦301的74.53%(图2-A)。进一步对比发现,突变体dmc只有4个节间,比国麦301少了一个节间,与突变亲本国麦301相比,突变体dmc各节间长度(倒Ⅰ-倒Ⅳ)均缩短(图2-F);而且突变体dmc倒Ⅰ节间的直径比国麦301要小(图2-E)。
 
  图2 突变体dmc和国麦301主要农艺性状比较

      A: 抽穗期突变体dmc(右)与国麦301(左)植株对比,B: 突变体dmc(右)和国麦301(左)穗部对比,C: 灌浆期突变体dmc(右)和国麦301(左)籽粒对比,D: 蜡熟期突变体dmc(右)和国麦301(左)籽粒对比,E: 突变体dmc(下)和国麦301(上)倒1节间直径对比,F: 突变体dmc(右)和国麦301(左)节间对比。
 
      ▶2.2 遗传背景检测
 
      利用 SSR标记对突变亲本国麦301与突变体dmc的遗传背景进行检测比较,结果显示分布在42条染色体上的431个SSR标记扩增位点均没有发现差异性条带,表明突变亲本国麦301与dmc的遗传背景高度一致。这个结果证明突变体dmc是由国麦301诱变而来的。
 
 
M: 分子量标准(DL100);泳道1-3:国麦301,泳道4-6:突变体dmc,扩增产物条带下是SSR引物名称
 
图3 SSR标记检测
 
      ▶2.3 国麦301和突变体dmc的组织学观察
 
      通过比较不分蘖突变体dmc和野生型对照国麦301的分蘖形态和显微结构,发现dmc中主茎基部的分蘖分化和发育都受到严重抑制(图4A-E)。在两叶期,dmc和国麦301在外部形态上几乎没有差异。组织学观察发现,国麦301的分蘖原基已经开始分化(图4F),但在dmc中未观察到分蘖原基(图4A)。在三叶期,国麦301的分蘖芽开始生长,在主茎基部形成两个一级分蘖(图4G),而在dmc基部仅形成一个微小的突起(图4B)。在四叶期,国麦301的主茎变长且增厚,分蘖原基增多(图4H,图5A)。同时期的dmc的主茎也伸长,可以观察到一个微小的分蘖原基在基部(图4C)。在越冬期,dmc平均株高(在自然状态下的最高离地高度)仅为12cm,是国麦301平均株高的一半(图5B)。组织学观察发现在dmc基部只有两个小分蘖原基(图4D),但国麦301处于分蘖旺盛期,分蘖数约为12-14个,分蘖主要由一级分蘖和二级分蘖组成(图4I)。在起身到拔节阶段,dmc的分蘖几乎与前期一样很小(图4E)。然而,国麦301的分蘖数已达到最大值(图4J, 图5C)。大多数dmc最终只有一个主茎(图5C)。
 
 
图4 矮化不分蘖小麦突变体dmc和国麦301的分蘖组织显微观察

  (A、B、C、D、E:二叶期、三叶期、四叶期、越冬期和起身到拔节期之间的dmc;F、G、H、I:二叶期、三叶期、四叶期和越冬期的国麦301;J:起身到拔节期之间的国麦301的部分分蘖芽。MC:主茎;TP:分蘖原基;PT:一级分蘖;ST:二级分蘖。A-H,比例尺=1 mm;I和J,比例尺=1cm。)
 
      ▶2.4 国麦301和突变体dmc的组织化学观察
 
      在组织化学水平上,三叶期突变体dmc的分蘖原基与国麦301的分蘖原基有明显区别。dmc中通常只有一个小的分蘖突起,被染成淡黄紫色;相反,国麦301通常有两个分蘖芽,里面包裹着分蘖原基,被染成深黄色。这些表型说明国麦301的分蘖原基蛋白质含量明显高于dmc。此外,在国麦301的横切面上,有两个明显的黄色区域,即旺盛分蘖的原基部位。国麦301分蘖原基细胞排列整齐,胞质致密被染成深黄色,呈现典型的分生组织特征。然而,在dmc横切面中通常看不到分蘖原基及分生组织。总之,dmc分蘖原基少且分蘖原基蛋白质含量低于对照国麦301(如图4)。
 
      (A:dmc(箭头)分蘖的纵切面;B:国麦301(箭头)分蘖的纵切面;C:dmc分蘖基部的横切面;D:国麦301分蘖基部的横切面;E:C的放大图;F:D的放大图。TP:分蘖原基;TB:分蘖芽。
 
 
图5 三叶期的国麦301和dmc小麦分蘖中淀粉(紫色)和蛋白质(黄色)的分布
 
      ▶2.5 突变体dmc遗传学初步分析
 
      突变体dmc与中国春进行杂交,对F₁进行性状调查,结果发现F₁分蘖均减少,平均分蘖4.48个,而F₁株高介于两亲本之间。初步推测突变体dmc的独秆性状可能是由显性或半显性基因控制。
 
表2 突变体dmc、中国春及其F1代的株高和分蘖性
 
 
      3 小麦提前终止穗分化突变体ptsd1遗传调控机制研究
 
      ▶3.1突变体ptsd1表型分析
 
      突变体ptsd1的平均株高和穗长分别为50.75cm和4.19cm,与亲本国麦301相比分别降低了21.1%和缩短了60.0%。突变体ptsd1的平均可育小穗数和单穗籽粒数为4.50和14.16,与亲本国麦301相比分别减少了77.5%和77.9%。千粒重相比于亲本降低了19.8%。突变体ptsd1的抽穗期、开花期和成熟期分别推迟了9天、9天和11天。突变体ptsd1主要影响穗长和小穗数性状(图6)。
 
 
图6 对照国麦301和突变体ptsd1整株表型(A)和穗部表型(B)
 
      ▶3.2 突变体ptsd1幼穗分化的超微结构
 
      对照国麦301顶端小穗形成期幼穗超微结构显示(图8A),顶端分生组织(im)分化形成最后几个顶端小穗原基,上部小穗原基已经分化形成护颖原基、外稃原基和小花原基凸起,中部小穗中的小花原基已经分化形成三个雄蕊原基凸起(stp)和一个雌蕊原基凸起(pip)。突变体ptsd1只有约5个小穗原基正常分化(图8B),小穗中的小花原基分化形成三个雄蕊原基凸起(stp)和一个雌蕊原基凸起(pip),而上部小穗原基停止分化,最终形成一个个凸起状结构。经过越冬期,顶端分生组织逐渐从营养生长阶段向生殖生长阶段过渡,顶端圆锥体迅速伸长(图7 A、A');在二棱期(图7 B、B'),对照国麦301和突变体ptsd1在都形成小穗脊(spr)结构;在二棱后期(图7 C、C'),对照的穗轴两侧小穗原基(spp)逐渐开始膨大,首先观察到中部小穗原基的膨大,然后向顶端和基部延伸,而突变体ptsd1的上部小穗原基停止分化,下部小穗原基逐渐开始膨大;在护颖原基形成期(图7 D、D'),对照护颖原基(glp)逐渐形成,大约形成12 ~ 14个小穗原基,而突变体ptsd1只形成6 ~ 8个小穗原基;在外稃原基形成期(图7E、E'),对照在护颖原基上方形成了外稃原基(lemp),大约形成14 ~ 16个小穗原基,而突变体ptsd1只形成6 ~ 8个小穗原基,上部小穗原基仍停留在二棱期;在小花原基形成期(图7 F、F'),中部小穗的第一个小花原基(flp)分化形成,小花原基位于外稃原基上方,呈半球状,大约形成16 ~ 18个小穗原基,而突变体ptsd1只形成6 ~ 8个小穗原基,上部小穗原基仍停留在二棱期;在顶端小穗形成期(图7 G、G'),在这个时期对照除了最后几个顶端小穗原基分化外,不再形成新的小穗原基,而突变体ptsd1上部小穗原基仍停留在二棱期;在小穗原基分化结束后,对照小花原基逐渐开始分化最终形成雌蕊和雄蕊(图7H、I、J和K),突变体ptsd1下部小花原基正常分化形成雌蕊和雄蕊,而突变体ptsd1上部未分化的小穗原基没有分化形成小花原基及随后的雌雄蕊(图7 H'、I'、J'和K')。在绿色花药时期,对照国麦301的上、中和下部小穗中均观察到正常的雌雄蕊形态(图7 L、M和N),而突变体ptsd1上部小穗原基未分化没有形成雌雄蕊(图7L'),突变体ptsd1的中部和下部小穗中均观察到正常的雌雄蕊形态(图7M'和N')。观察记录穗发育时期发现,突变体ptsd1顶端圆锥体比囯麦301晚11天进入二棱期,且整个穗分化进程延迟了11天。
 


 图7 对照国麦301(A-N)和突变体ptsd1(A'-N')的穗分化不同时期形态
 
      注:A:二棱初期,B:二棱期,C:二棱后期,D:护颖原基形成期,E:外稃原基形成期,F:小花原基形成期,G:顶端小穗形成期,H:雌雄蕊原基分化期,I:雌雄蕊原基分化末期,J:外稃完全包裹基部两个小花,K:绿色花药时期,L-N:绿色花药时期对照国麦301的上、中和下部雌雄蕊形态。A'-N': 突变体ptsd1与对照发育时期一一对应。spr,小穗脊;spp,小穗原基;spd,小穗分生组织的圆顶;glp,护颖原基;lemp,外稃原基;flp,小花原基;ts,顶部小穗;an,花药。红色括号标注的是从二棱期开始突变体ptsd1上部小穗原基不分化。小麦穗发育时期参考文献。
 
 
注:Im,花序分生组织;stp,雄蕊原基;pip,雌蕊原基
 
图8 对照国麦301(A)和突变体ptsd1(B)顶端小穗形成期幼穗超微结构
 
      ▶3.3 遗传分析
 
      突变体ptsd1与周麦18杂交组合,正反交F₁穗长正常(图9A-D),表明控制穗长性状位点为隐性基因。“ptsd1 × 周麦18”杂交F₂,穗长性状分离为三种表型,正常穗(NSL)、中等缩短穗(MSL)和极端缩短穗(ESL)。其中,正常穗的长度与亲本周麦18穗长相当,中等缩短穗的长度介于周麦18和突变体ptsd1之间,极端缩短穗的长度与突变体ptsd1相当。统计595个F₂单株穗长表型发现,正常穗、中等缩短穗和极端缩短穗分别为503、68和24个单株(表3)。假设穗长由一对隐性基因控制,统计正常穗和中等缩短穗(NSL和MSL)为571株,极端缩短穗(ESL)为92株,χ2检验结果显示χ2 > P0.05,不符合孟德尔单基因遗传3:1的分离比,因此突变体ptsd1不是单基因隐性遗传。假设穗长由两对隐性基因控制,χ2检验结果显示χ2 > P0.05,不符合15:1的分离比,因此突变体ptsd1也不符合孟德尔两对独立的隐性基因遗传。
 
 
      图9 对照国麦301(A)、突变体ptsd1(B)、周麦18(C)、ptsd1与周麦18正反交F₁(D)以及后代F₂或F2:3穗部形态(E-H)。
 
表3  F₂群体穗长性状遗传分析
 
 
      ▶3.4 结论
 
      周麦18和中国春分别与突变体ptsd1杂交,F₁穗型都正常,表明ptsd1控制穗长性状是由隐性基因控制的。在F₂和F2∶3群体中,正常和突变植株的分离比不符合经典孟德尔遗传学的1对隐性基因或2对独立分配、自由重组的隐性基因遗传的理论分离比。表明突变体ptsd1中,穗长性状不是由一对隐性基因也不是由两对独立遗传隐性基因控制。660K芯片SNP标记连锁分析和SSR标记连锁分析表明,在5A染色体的短臂和长臂上各有一个突变位点。因为这两个突变位点在同一条染色体上,存在基因连锁,所以遗传分离比不符合15:1。为此,ptsd1是首次发现的在5A染色体上同时存在两个基因控制穗分化的突变体。未来,我们将把这两个基因分解到不同的作图群体中,从而对每个基因进行图位克隆。
 
      基于目前的研究结果,构建了突变体ptsd1的遗传模型(图10)。将两对基因的四种基因型分别用A、a、B和b代替,如A:Ptsd1-5AS,a:ptsd1-5AS,B:Ptsd1-5AL和b:ptsd1-5AL。突变体ptsd1携带两对隐性基因aabb,正常穗长植株携带两对显性基因AABB,杂交F₁基因型为AaBb。F₁自交两代,在F2∶3筛选穗长分离的家系。根据F2∶4的分离情况,确定F2∶3家系单株是否纯合。筛选纯和的正常穗基因型AABB和极端缩短穗基因型aabb纯合株系构建BSA混池,本研究筛选获得的连锁标记都是基于这两个混池。
 
      将两个基因分解到两个遗传群体的方法有以下两种:
 
      1)筛选穗长性状分离的杂合F2∶3植株,根据连锁标记鉴定F2∶3中基因型为aaBb和Aabb的单株,自交一代得到F2∶4家系群体为一个基因纯合,另一个基因分离的遗传群体;
 
      2)筛选穗长性状不分离的纯合F2∶3植株,根据连锁标记鉴定F2∶3中基因型为aaBB和AAbb的单株,与突变体ptsd1回交一代得到基因型为aaBb和Aabb的单株,自交后获得单个基因的遗传群体。
 
 
图10 突变体ptsd1的遗传模型
 
      来源:一麦众承
 
 
 
 
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